Информационный сайт для врачей и студентов-медиков

  Иммуноанализ - это применение реакции антигена с антителом для определения концентрации одного из этих реагентов в растворе. "Комплементарные иммуноанализы" (в оригинале книга носит название "Complementary Immunoassays". - Перев.) можно определить как методы, используемые для быстрого получения более полной информации об аналитической методике, природе определяемого вещества или диагностической проблеме. 
В настоящее время существует такое большое количество различных альтернативных методик иммуноанализа, что химику-аналитику очень трудно сразу выбрать какую-нибудь конкретную методику для решения определенной задачи. Ситуация еще более усложняется в силу того, что в зависимости от способа классификации и сферы использования одна и та же методика может иметь различные названия.
При оценке возможностей и отнесении того или иного метода иммуноанализа к определеному типу во внимание принимаются главным образом следующие факторы:

1) основной принцип;
2) стандартные препараты и матрикс; 
3) характеристики используемых антител;
4) система разделения (может включать твердый носитель для одного из реагентов);
5) тип метки, применяемой для контроля реакции связывания;
6) тип реакции и система детектирования.
 

В соответствии с лежащими в их основе принципами методы иммуноанализа можно подразделить на три основные группы: 

1) конкурентное связывание: при этом достаточно одной антигенной детерминанты на определяемом веществе, анализ выполняется в условиях ограниченных количеств реагента;
2) неконкурентное связывание: на определяемом веществе должны быть две неперекрывающиеся антигенные детерминанты, анализ выполняется в условиях избытка реагента;
 3) неравновесный режим: используются одна антигенная детерминанта и строго контролируемый избыток реагента

  Первая группа методов является обычным конкурентным связыванием в присутствии ограниченного постоянного количества меченого антигена или специфического антитела, немеченый реагент при этом может быть связан с твердой подложкой. По завершении реакции количество меченого реагента, связанного с твердой фазой, будет обратно пропорционально количеству определяемого вещества в образце. Естественно, что наличие фонового сигнала будет оказывать диспропорционирующий эффект на результаты измерения высоких концентраций вещества. В случае хорошо оптимизированной методики вещество можно определять с высокой точностью (коэффициент вариации менее 10%) в широком (два-три порядка) диапазоне концентраций. Чувствительность методики зависит как от ошибок практического характера (точность отбора пробы, антител, антигена и способ измерения сигнала), так и от аффинности антител.

Второй тип методов известен как "сандвич"-анализ. Методы этого типа применяются сравнительно недавно для определения веществ с молекулярной массой более 1000, имеющих как минимум две антигенные детерминанты (эпитопы). В этих методах избыток связывающих антител прямо или опосредованно связывают с твердой фазой. Вторые меченые антитела против другого эпитопа добавляют или одновременно при связывании с антителами первого типа (одностадийный метод), или после завершения стадий связывания и отмывки (двухстадийный метод). После завершения иммунологической реакции количество связавшегося с твердой фазой вещества непосредственно зависит от количества определяемого вещества в пробе. Уровень фона (неспецифического сигнала) наиболее сильно влияет при низких концентрациях определяемого вещества. В данном случае хорошо подобранная аналитическая система позволяет определять соединения в диапазоне концентраций, составляющем чётыре-пятъ порядков с коэффициентом вариации менее 5%. Чувствительность методики зависит от ошибок при отборе проб, уровня фона и констант связывания антигена с антителами.

Методы третьего типа являются предельным вариантом методов первого типа; их называют одноцентровым иммундметриче-ским анализом и используют главным образом для определения веществ с молекулярной массой менее 1000. В этих методах определяемое вещество связывается со строго определенным избытком меченых антител, или, лучше, Fab-фрагментов, для обеспечения одноцентрового связывания. Далее в систему добавляют антиген или антиидиотипические антитела на твердом носителе для удаления несвязавшихся антител. Вероятно, методы третьего типа правильнее называть неравновесным иммуноанализом с контролируемым избытком реагентов.

Форма аутентичного материала и окружающего матрикса стандартного препарата также влияет на тип и возможности иммуноанализа. Стандартные препараты используются

1) в качестве антигенов на твердой фазе;

2) для получения антител;

3) для прямого определения микроорганизмов и макромолекул;

4) для определения выделенных гаптенов;

5) для прямого определения общего количества гаптенов или несвязанных с белками гаптенов.

Многие гаптены и небольшие пептиды можно синтезировать химически, в то время как большие молекулы получают микробиологическим путем.

Антитела являются одним из наиболее важных реагентов при определении антигенов методом иммуноанализа. Антитела могут быть

1) поли- или моноклональными;

2) различного типа (IgG или IgM) и подтипа (IgGl, IgG2a);

3) моно-, би- или поливалентными;

4) моно- или биспецифическими;

5) антиаллатипическими или антиидиотипическими;

6) нативными или полученными химическим или генно-инженерным путем;

7) мечеными или связанными тем или иным способом с твердой фазой.

Поликлональная антисыворотка может содержать до 10 000 различных типов молекул IgG. Напротив, все молекулы монокло-нальных антител должны быть идентичными. Моноклональные антитела предпочтительнее в методах конкурентного иммуноанализа, поскольку в этом случае можно утверждать, что меченый или связанный с твердой фазой антиген и определяемое вещество конкурируют за один и тот же центр связывания. Моноклональные антитела очень хорошо работают в "сандвич"-анализе, поскольку, как правило, хорошо известна специфичность их эпитопов. Такие антитела легко получать в больших количествах и с высокой степенью чистоты. Большинство нативных антител бивалентны, и все они моноспецифичны. Недавно с помощью гибридных гибридом и методов генной инженерии получены новые типы антител. Антитела могут быть мечеными или связанными с твердой фазой с помощью пассивной адсорбции или за счет ковалентных связей.

На ранних этапах развития иммуноанализа предпочтение отдавалось жидкофазным методикам, в которых связавшиеся антитела осаждали (например, с помощью вторичных антител) или несвязавшийся антиген удаляли адсорбцией с помощью активированного угля, покрытого декстраном (твердофазный реагент). В настоящее время наиболее распространены твердофазные методики, поскольку они позволяют существенно упростить проведение анализа и уменьшить фоновый сигнал. Предлагались следующие типы носителей:

1) трубки (например, стеклянные, полистирольные, полипропиленовые) ;

2) гранулы (например, активированного полистирола);

3) мелкие частицы (например, полиакриламида, целлюлозы, сефарозы);

4) микропланшеты или полоски (например, полистирольные);

5) дипстики, карточки, стержни (например, полистирольные);

6) электроды (например, платиновые, углеродные);

7) пленки или волокна (например, стеклянные, кварцевые). Если система включает электрод, то ее можно назвать био- или иммуносенсором.

В качестве меток для контроля реакции антиген - антитело рекомендовались:

1) частицы (например, эритроциты, латексы);

2) золи металлов и красителей (например, золото, Palanil® Luminous Red G);

3) радионуклиды (например, иод-125, тритий);

4) ферменты, субстраты, кофакторы; .

5) потенциальные люминофоры (например, производные изо-люминола, эфиры акридина);

6) электрохимически активные соединения (например, диме-тиламинометил ферроцен).

Люминесценция - это процесс излучения света веществом, находящимся в электронно-возбужденном состоянии. В зависимости от источника энергии, необходимой для перевода электронов в возбужденное состояние, различают несколько типов люминесценции, а именно:

1) радиолюминесценция,

2) фотолюминесценция - флуоресценция и фосфоресценция,

3) хемилюминесценция и биолюминесценция,

4) термохемилюминесценция,

5) электрохемилюминесценция,

6) сонохемилюминесценция.

Возможны и другие сочетания (фототермолюминесценция, электротермолюминесценция и т. д.). Иногда, например при флуоресценции и электролюминесценции, одна и та же молекула может последовательно испускать несколько фотонов.

Одни метки предпочтительнее при проведении анализов вне лаборатории, другие дают лучшие результаты в высокочувствительных анализах, чувствительность которых зависит от удельной активности реагента и отношения сигнал /шум. Тип метки часто используется наряду с основным принципом при описании и классификации методов иммуноанализа (радиоиммуноанализ, иммуно-радиометрический анализ, иммуноферментный анализ, ферментативный иммунометрический анализ и т. д.). Кроме того, в описании может быть указано и использование твердой фазы, например твердофазного иммуноферментного анализа ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay). Меченый реагент иногда называют биозондом.

Для определения меченых соединений и комплексов можно применять различные методы: 

1) оптические:

фотометрические, включая нефелометрические (для мечных соединений и продуктов);

фотоэмиссионные, в том числе измерение

- флуоресценции (поляризационной и с временным разрешением) ;

- фосфоресценции;

- хемилюминесценции (со свечением более 180 с и импульсной со свечением менее 20 с);

измерение рассеяния и отражения фотонов частицами в растворе и реагентами на поверхностях;

2) электрические: потенциометрические; амперометрнческие;

3) термические: калориметрические;

4) акустические: сонометрические.

На завершающем этапе иммуноанализа величина сигнала от метки может быть выражена в виде ее общего количества или в виде концентрации. Кроме того, непосредственно определяемой величиной может быть скорость реакции. Способ регистрации также можно использовать для классификации методов иммуноанализа (оптический иммуноанализ, амперометрический иммуноанализ и т. д.). 

Кроме того, методы иммуноанализа можно классифицировать по способу осуществления:

1) жидкофазные или твердофазные,

2) ручные, полуавтоматические или автоматические,

3) с разделением (гетерогенные) или без разделения (гомогенные),

4) с экстракцией или без экстракции.

Жидкофазные или твердофазные методы могут быть ручными, полуавтоматическими с частичным участием оператора или полностью автоматическими (после завершения операций подготовки пробы). Кроме того, они могут включать или не включать стадию разделения свободного и связанного с антителами определяемого вещества. Наконец, исследуемое вещество можно определять или после выделения, или непосредственно в исходном образце. Долю не связанных с белками (т.е. кажущихся свободными) гаптенов можно оценить непосредственно.

Дальнейшее развитие методик иммуноанализа необходимо для решения следующих задач:

1) расширения круга определяемых соединений;

2) повышения чувствительности (например, при определении вирусных и бактериальных антигенов и опухолевых маркеров);

3) расширения рабочего диапазона концентраций (что позволит обходиться без разбавления проб);

4) сокращения времени проведения анализа;

5) развития внелабораторных й домашних диагностикумов;

6) разработки методик одновременного определения нескольких веществ или объектов, например для оценки гормональных и бактериальных профилей;

7) производства реагентов и наборов с большим сроком хранения в неблагоприятных условиях;

8) государственной и межгосударственной стандартизации.

Методы иммуноанализа

Scroll To Top
[ Reset Settings ]
Rambler's Top100
Картаsns krf e0 nd5 ah81 rod solnce rod solnc cent1 cen40
rss
Карта