Информационный сайт для врачей и студентов-медиков

Библиотека - Иммунологические методы (Под редакцией Г. Фримеля)

прекращения захвата частиц). Центрифугируют 10 мин при 250 g. Надосадочную фракцию отбрасывают, осадок ресуспен-дируют в растворе NaCl и N-этилмалеимида (см. выше), дважды отмывают клетки. Лизируют клетки ультразвуком, происходит высвобождение масляного красного. Добавляют 1 мл диок-сана. Центрифугируют 15 мин при 500 g, измеряют оптическую плотность на волне 525 нм против чистого диоксана. Степень фагоцитоза (ИФ) определяют как количество минерального масла (мг), поглощаемого в минуту 107 клетками. Для подсчета можно использовать следующую формулу:

цф _ ОГЬиХфактор пересчета (см. 3.21.2.3) ~~ время инкубацииХчисло фагоцитов *

Исследование фагоцитоза в монослое макрофагов:

1. Фаза: в стерильные полистирольные пробирки вносят по 2 мл суспензии клеток (200 000 клеток/мл). Инокулируют 5 ч при 37°С, затем отмывают средой Игла. Вносят в пробирки 2 мл культуральной среды с 10% инактивированной (30 мин, 56 °С) сыворотки эмбрионов коров, инкубируют при 37 °С.

2. Фаза А: вносят суспензию микробов (3—10/макрофаг), инкубируют 30—60 мин при 37 °С, 6 раз ополаскивают пробирки порциями среды по 3 мл для удаления нефагоцитированных микробов. Немедленно фиксируют препарат смесью 1 части ледяной уксусной кислоты с 3 частями метанола. Окрашивают препарат по May — Grunwald, подсчитывают клетки.

Фаза Б: определение внутриклеточных живых бактерий. Последовательность операций та же, что и в фазе А до этапа фиксации. После отмывки тщательно удаляют все следы среды. Лизируют клетки, для чего вносят 2 мл 0,01% стерильного раствора БСА (4°С), многократно встряхивают. Большая часть клеток лизируется через 20 мин. Высвободившиеся бактерии определяют путем рассева на плотные питательные среды.

Фагоцитоз эритроцитов: смешивают 4ХЮ7 фагоцитов с 5Х ХЮ7 тест-эритроцитов в 5 мл ФСБ. Переносят 2 мл смеси в охлажденный до 0°С 5 мМ фосфатный буфер и центрифугируют. Измеряют оптическую плотность надосадочной фракции при длине волны 420 нм. Степень фагоцитоза определяют по снижению содержания гемоглобина в бесклеточной фазе при помощи калибровочных кривых.

3.21.2.5. УПРОЩЕННЫЙ МЕТОД

ОПРЕДЕЛЕНИЯ КЛИРЕНСА

Пример определения клиренса на крысах: животным вводят внутрибрюшинно по 5Х107 микробов на 100 г веса (0,1мл/ /100 г). Оптимальная доза может колебаться от 10е до 108 на 100 г веса. С интервалом 1—2 ч из каждой группы экспериментальных животных забивают по 3 особи; общая продолжительность эксперимента 16 ч. Стерильно берут 0,5 мл крови из серд-

Методы иммуноанализа

Scroll To Top
[ Reset Settings ]
Rambler's Top100
Картаsns krf e0 nd5 ah81 rod solnce rod solnc cent1 cen40
rss
Карта