Библиотека - Иммунологические методы (Под редакцией Г. Фримеля)

Осаждение риванолом. Риванол образует с сывороточными белками комплексы, которые выпадают в осадок, но растворяются при рН 5. Ввиду высокой изоэлектрнческой точки IgG по сравнению с остальными сывороточными белками в слабощелочной среде риванол не образует комплексов с IgG. На этом основана очистка IgG. К сыворотке добавляют раствор риванола (7,5 г/л) прн постоянном перемешивании. Осадок удаляют центрифугированием. IgG остается в надосадочной фракции. Риванол можно удалить активированным углем (10 мг/мл) или NaCl (до 50 г/л). Соотношение сыворотки и риванола может быть различным. Наилучшее соотношение сыворотка/риванол при выделении человеческого IgG равна 1+2. На одни объем сыворотки животных берут 1—1,5 объема риванола. При обработке сыворотки человека используют даже соотношение 1 + 3—3,5.

Фракционирование органическими растворителями. У этого вида фракционирования есть недостаток: необходим строгий контроль температуры и рН. Поскольку органические растворители легко вызывают денатурацию, необходимо проводить работу при температуре ниже ОС. Чаще используют этанол при фракционировании белков плазмы человека. В лаборатории к фракционированию этанолом прибегают редко, однако в промышленности этот метод нашел широкое применение. Так называемая II фракция по Кону состоит в основном из IgG.

4.1.1.3. ПОЛУЧЕНИЕ IgG

ИЗ СЫВОРОТКИ ЧЕЛОВЕКА

4.1.1.3.1. Материалы и оборудование

Для работы необходимы сыворотка человека, ДЭАЭ-сефадекс (Pharmacia, Швеция), 0,1 М н 0,01 М фосфатный буфер с рН 6,5, 0,1 М Н3Р04, 0,5 М NaOH, 1 М К2НРО4, 1 М NaCl.

4.1.1.3.2. Методика

Дают ДЭАЭ-сефадексу А-50 набухнуть, мелкие частицы декантируют. Отмывают 0,5 М NaOH до тех пор, пока промывная жидкость не освободится от ионов хлора. Отмывают сорбент водой до достижения нейтрального рН. При помощи 0,1 М фосфорной кислоты переводят обменник в фосфатную форму. Добавляют такое количество кислоты, чтобы надосадочная фракция имела выраженную кислую реакцию. Отмывают избыток кислоты дистиллированной водой, уравновешивают сорбент 0,1 М фосфатным буфером с рН 6,5, затем 0,01 М фосфатным буфером с рН 6,5. К 100 мл сыворотки человека добавляют 20 г набухшего уравновешенного ДЭАЭ-сефадекса А-50. Сыворотку можно предварительно продиализовать против 0,01 М фосфатного буфера с рН 6,5. Смесь периодически суспендируют в течение часа (4°С). Затем фильтруют и 4 раза отмывают порциями 0,01 М буфера по 50 мл. Фильтрат и промывную жидкость объединяют н снова инкубируют с 20 г ДЭАЭ-сефадекса в тех же условиях.

Методы иммуноанализа

Scroll To Top
[ Reset Settings ]
Rambler's Top100
Картаsns krf e0 nd5 ah81 rod solnce rod solnc cent1 cen40
rss
Карта