ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ С УСИЛЕННОЙ ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИЕЙ

Определять ферментную метку количественно можно различными методами, например с помощью колориметрии, флуориметрии, радиометрии и потенциометрин [1]. Недавно для этой цели стали применять также хемилюминесценцию или биолюминесценцию. Ферментные метки, которые можно определять с помощью реакций, сопровождающихся излучением света, представлены в табл. 12.1. В общем случае чувствительность хеми- и биолюминесцентных методов определения очень высока, а если использовать еще и усиление сигнала от ферментной метки, то чувствительность соответствующих методик иммуноанализа должна быть чрезвычайно высокой. Возможности биолюминесцентного метода недавно были продемонстрированы на примере определения b-галактозидазы. С помощью сопряженной реакции галактозо-дегидроге-наза-NADH:FMN-оксидоредуктаза-бактериальная люцифераза удалось обнаружить 2 • 10-22 моля B-галактозидазы (т.е. всего лишь 60 молекул) [2 ].

Таблица 12.1. Ферментные метки, определяемые с помощью хемилюминесценции и биолюминесценции

Фермент

Система анализа

Литература

Бактериальная люцифераза

ФМНН2, длнниоцепочечный альдегид

[4]

Светляковая люцифераза

АТФ, люциферин

[5]

Пируваткиназа

Система светляковой люциферазы

[6]

Глюкозооксидаза

Люминол или бис-(2,4|б-трихлорфенил)оксалат [7]

Глюкоза-6-фосфат-

дегидрогеназа

НАД, глюкоза-6-фосфат,

система светляковой люциферазы

[8]

Щелочная фосфатаза

Г>люциферин-0-фосфат

[9]

b-Галактозидаза

Система галактозо-дегидрогеназа •

бактериальная люцифераза

[101

Пероксидаза хрена

Люминол - пероксид водорода

[11]

 

Люциферин Photos dactytus

[12]

 

Пурпурогаллнн - пероксид водорода

[13]

ФМНН2 - восстановленный флавиимононуклеотид; АТФ - адёнозинтрифосфат; НАД - никотииамидадениндинуклсотид.

В качестве метки в иммуноферментном анализе широко применяют пероксид азу хрена, методы получения и стабилизации конъюгатов с которой хорошо изучены. Пероксид азу хрена чаще всего определяют колориметрически, но для этой цели можно также использовать различные хеми- и биолюминесцентные реакции (см. табл. 12.1).

Детально изучено определение пероксидазы с помощью хемилюминесцентной реакции в системе люминол - пероксид водорода, усиленной фенольными соединениями (усиленная хемилюминес-ценция) [3]. Такой подход к определению активности фермента имеет ряд преимуществ в сравнении с другими методами определения; его основные характеристики перечислены в табл. 12.2. В сле-дущих разделах обсуждаются особенности реакции усиленной хе-

Таблица 12.2. Преимущества иммуноферментного анализа с усиленной хемилюминесценцией

Характеристики

Продолжительное и относительно постоянное по ннтенсявности излучение света

Преимущества

Упрощение инициирования реакции и измерений

Высокая интенсивность излучаемого света

Упрощение измерений, возможность применения простых детекторов

Высокая чувствительность, скорость, снижение числа возможных перекрестных реакций

Простота, мягкие условия, недорогие реагенты

Улучшение соответствующих характеристик метода

Упрощение и повышение практичности метода

Доступность пероксидазы хрена и ее конъюгатов

Упрощение разработки методик определения различных веществ

милюминесценции для пероксидазы как метки и их применение в иммуноанализе.

12.1.1. Усилители. Способностью усиливать излучение света в реакции окисления люминола пероксидом водорода, катализируемой пероксидазой, обладают различные соединения, в том числе 6-гидроксибензотиазолы, например люциферин, фенолы, нафтолы и амины [14-16]. На рис. 12.1 изображены структуры представителей веществ каждого класса. Степень усиления излучения света зависит от концентрации реагентов. Типичная зависимость интенсивности свечения от концентрации усилителя в реакции люминола с пероксидом водорода, катализируемой пероксидазой и усиливаемой 6-гидрокси-бензотиазолом, представлена на рис. 12.2.

12.1.2. Синергизм и степень усиления. 


Люциферин светляка л-Гидроксикоричная кислота

Рис. 12.1. Структурные формулы соединений, усиливающих реакцию хемилюминес-цеиции люминола с пероксидом водорода, катализируемую пероксидазой.

Рис. 122. Влияние концентрации усиливающего реагента б-гидроксибенэотиаэола на излучение света в катализируемой пероксидазой реакции люминола с пероксидом водорода (воспроизведено с разрешения из работы [16]).

В системе пероксидаза - люминал - пероксид водорода наблюдается эффект синергизма, о чем свидетельствуют данные, приведенные в табл. 12.3. На степень усиления влияют многие факторы (например, природа усилителя и его концентрация, тип пероксидазы); тем не менее достигнуто усиление излучения света более чем в 500 раз. В присутствии некоторых усилителей фоновое излучение света в системе люминол - пероксид водорода уменьшается. При определении активности пероксидазы это позволяет на несколько порядков повысить отношение сигнала к шуму только, за счет применения таких усилителей (см.табл. 12.3).


Таблица 123. Синергизм в системе люминол - пероксид водорода - пероксидаза хрена - 6-гидроксибензотиазол

Компоненты реакции

Интенсивность излучения через 60 с, мВ

Люминол

Н202

Конъюгат ПХ

_

22

Люминол

Н202

Коныогат ПХ

6-ГБТ

11410

Люминол

Н202

-

-

10

-

Н202

-

6-ГБТ

<1

-

Н2022

Конъюгат ПХ

6-ГБТ

8

Люминол

-

-

6-ГБТ

<1

Люминол

-

Конъюгат ПХ

6-ГБТ

<1

Люминол

Н202

-

6-ГБТ

<1

Н202 - пероксид водорода; ПХ - пероксидаза хрена; 6-ГБТ - б-гидроксибенэотиазол.

Усиление свечения характерно для различных циклических диацилгидразидов (например, изолюминола), при действии окислителей (например, пербората) в присутствии пероксидазы [3 ]. Усиление не наблюдается в случае некоторых веществ с перокси-дазной активностью, например гемоглобина, который катализирует только колориметрические реакции. Этот факт свидетельствует о более высокой специфичности усиленного хемилюминесцентного анализа по сравнению с колориметрическими методами. Спектры излучаемого света практически одинаковы в усиленных и неусиленных реакциях. Это "говорит о том, что сам по себе усилитель не излучает свет.

В отсутствие усилителей хемилюминесценция в системе пе-роксидаза-люминол-пероксид, по-видимому, лимитируется относительно медленной реакцией пероксидазы, находящейся в форме так называемого соединения II, с люминолом, в результате которой образуются люминольные радикалы и регенерируется перокси-даза. Усилители, способные быстро реагировать с таким соединением, могут увеличивать излучение света, ускоряя превращение соединения II в активную пероксидазу. Продукты превращения усилителя (например, фенольные радикалы) могут затем быстро реагировать с люминолом, образуя дополнительные люминольные радикалы и тем самым способствуя дальнейшему усилению излучения света. (В работе [17] показано, что роль усилителя в реакции усиленной хемилюминесценций главным образом обусловлена реакцией диспропорционирования между феноксильным радикалом и люминолом. - Ред.) Усилители могут воздействовать и на неактивные пероксидазные интермедиаты, например на соединение III.

12.1.3. Реагенты. Важным фактором в определении перокси-дазной активности с помощью усиленной хемилюминесценций является химическая чистота циклических диацилгидразидов. Изучение различных образцов люминола показало, что примеси отрицательно влияют на излучение света. В результате фотохимических и термических процессов люминол частично разлагается, а образующиеся примеси влияют на кинетику и интенсивность излучения света. В табл. 12.4 представлены результаты сравнения чистоты и свойств некоторых поступающих в продажу препаратов люминола, а также натриевой соли люминола, очищенной перекристаллизацией из раствора гидроксида натрия.

1 УСИЛЕННЫЙ ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ ИММУНОАНАЛИЗ

Методы иммуноанализа

Scroll To Top
[ Reset Settings ]
Rambler's Top100
Картаsns krf e0 nd5 ah81 rod solnce rod solnc cent1 cen40
rss
Карта