Информационный сайт для врачей и студентов-медиков

ТЕРМОХЕМИЛЮСЦЕНТНЫЙ ИММУНОАНАЛИЗ

Люминесценцией называют излучение света в ходе какого-либо процесса. В зависимости от индуцирующего люминесценцию источника энергии ее можно подразделить на физическую люминесценцию и хемилюминесценцию (ХЛ). Физическая люминесценция включает флуоресценцию и фосфоресценцию. В этом случае люминесценция происходит после поглощения световой энергии. Хемилюминесценцией обычно называют излучение света в результате химической реакции. Харви [1 ] ввел дополнительное ограничение - "при обычной температуре**. 

 


Рис 14.1. Хемнлюминесцентная реакция дофина.

Позже Селиджер и Макэлрой [2 Гпредположили, что при люминесценции испускаемый свет должен иметь более высокую интенсивность, чем ожидаемое излучение черного тела вещества при той же температуре и в той же спектральной области.

Большинство органических хемилюминесцентных реакций можно отнести к окислительным процессам. Ряд таких реакций хорошо известен благодаря их применению в аналитической химии. Так, при окислении лофина (Ц (2,4,5-трифенилимидазола) в щелочной среде и некоторых близких по структуре соединений появляется обусловленная хемилюминесценцией зеленая окраска реакционной смеси [3-5]. Схема реакций представлена на рис. 14.1.

Люцигенин (II) (М,М'-бишетилакридинийннтрат) испускает сине-зеленый свет в присутствии пероксида водорода (Н,02) в щелочной среде (см. рис 14.2) [6 ]. Как показано на рис. 14.3, многие производные щавелевой кислоты реагируют с Н202, давая электронно-возбужденное промежуточное соединение, которое далее может вступить в реакцию с присутствующим в реакционной смеси соединением, способным к флуоресценции. В оптимальных условиях этот процесс является наиболее эффективным из нефермента-гивных хемилюминесцентных реакций, известных в настоящее время [7-12]. 

Рис. 143. Окисление люцигеиияа. 


Ряс. 143. Хемилюмниесценшн при окислении зфиров оксалатов.

Эфиры акридиния вступают в высокоэффективные жислительные хемилюминесцентные реакции с Н202, давая акридон (см. рис. 14.4) [13-15]. В известной степени эта реакции подобна биолюминесцентной системе люциферин-люцифераза у светляков. Вместе с хемилюминесцентным окислением люминола и близких производных гидразида фталевой кислоты перечисленные реакции пгароко использовались в хемилюминесцентных аналитических методиках. Во всех указанных реакциях образуется промежуточное соединение одного типа, а именно замещенный четырехчленный 1,2-диоксетан. Диссоциация этого ключевого интермедиа-та приводит к электронно-возбужденным карбонильным соединениям. Следовательно, во всех перечисленных хемилюминесцентных реакциях образуется очень лабильный 1,2-диоксетан, способный диссоциировать, давая люминесцирующее соединение.

За период с 1968 г., когда был синтезирован триметил-1,2-ди-оксетан [16], получено более 200 различных хемилюминесцентных 1,2-диоксетанов. Однако эти соединения не привлекли внимания специалистов в области иммуноанализа. Сейчас известно по крайней мере 10 различных методов синтеза 1,2-диоксетанов. Заместителями в этих соединениях могут быть алкильные, арильные, спироалкильные, спироарильные, алкоксильные, арилоксильные, алкиламинные, тиоалкильные и тиоарильные группы. Опубликован ряд обзоров, посвященных 1,2-диоксетанам (а также 1,2-диок-сетанонам и 1,2-диоксетандионам). В этих обзорах рассмотрены методы синтеза 1,2-диоксетанов, а также свойства этих соединений [17-28 ].

Рис. 14.4. Хеиилюминесценция акриднния.

Рис 14.6. Термическое разложение адамантилнденадамантан-1Д-диоксстана с хеми-люминесценцией.

1,2-Диоксетаны термически распадаются на два карбонильных соединения, одно из которых может быть в первом синглетном (Sj) или триплетном (ТО электронно-возбужденном состоянии. Как показано на рис. 14.5, возбужденное соединение может испускать свет при переходе в основное состояние или непосредственно (прямая хемилюминесценция, ХЛ), или путем переноса энергии (ПЭ) к акцепторной люминесцирующей молекуле А (хемилюминесценция с переносом энергии, ХЛПЭ).

Прямая хемилюминесценция 1,2-диоксетанов обычно очень слаба по сравнению с хемилюминесценцией таких соединений, как люминол. Это связано с тем,.что большинство кетонов, эфиров и альдегидов, являющихся продуктами диссоциации 1,2-диоксетанов, имеют низкую эффективность флуоресценции.

Энергия активации термического распада большинства 1,2-диоксетанов равна 20-26 ккал/моль. Это означает, что все такие соединения разлагаются в течение нескольких минут или самое большое Нескольких недель при комнатной температуре. Поэтому такие соединения не могут выполнять роль хемилюминесцентных меток в аналитических методах in vitro. В нашей лаборатории в 1972 г. был синтезирован чрезвычайно стабильный 1,2-диоксетан, а именно адамантилиденадамантан-1,2-диоксетан (соединение III, рис. 14.6) [29 ]. Это белое кристаллическое соединение (т. пл. 174-176°С) может храниться при комнатной температуре в течение нескольких лет без разложения до адамантанона (соединение IV, рис. 14.6). Вычисленный период полураспада соединения III при 25°С равен 104 лет. Термическое разложение этого соединения протекает по первому порядку, и скорость хемилюминесцентной реакции не зависит от концентрации 1,2-диоксетана. 



Рис. 14.7. Зависимость периода полураспада соединения III от температуры.

Рис. 14.8. Спектр хемилюнивесценцни соединения Ш при 200°С в атмосфере азота.

При повышении температуры период полураспада уменьшается экспоненциально. График такой зависимости для соединения III представлен на рис. 14.7.

Таким образом, форма кривой хемилюминесценции (зависимости I/Imax от времени) зависит от температуры. При определенной температурной программе и стандартном периоде измерений наблюдается постоянная кривая хемилюминесценции, не зависящая от концентрации. Поскольку эта хемилюминесценция инициируется и контролируется только температурой и не сопровождается никакими бимолекулярными реакциями, мы можем назвать этот процесс термохемилюминесценцией (ТХЛ). Как 1,2-диоксетан, так и продукт распада IV являются бесцветными соединениями, поэтому при высоких (локальных) концентрациях самогашение не наблюдается.

Не зависящий от концентрации спектр ТХЛ соединения III представлен на рис. 14.8. Максимум термохемилюминесценции находится при 425 нм. Спектр напоминает спектр флуоресценции адамантанона.

1 ПОЛУЧЕНИЕ МЕТОК И МЕЧЕНЫХ СОЕДИНЕНИЙ
2 ТЕРМОХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИЯ С ПЕРЕНОСОМ ЭНЕРГИИ
3 КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИНТЕНСИВНОСТИ ТЕРМОХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ
4 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ХОРИОНИЧЕСКОГО ГОНАДО-ТРОПИНА ЧЕЛОВЕКА С ПОМОЩЬЮ ТЕРМО-ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНТНОГО ИММУНОАНАЛИЗА
5 ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Методы иммуноанализа

Scroll To Top
[ Reset Settings ]
Rambler's Top100
Картаsns krf e0 nd5 ah81 rod solnce rod solnc cent1 cen40
rss
Карта