Вс, Окт 31, 2010
Text Size

Новые методы иммуноанализа - ИММУНОХЕМИЛЮМИНОМЕТРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ

В последние годы удалось значительно усовершенствовать хемилюминесцентные методы иммуноанализа. Так, в соответствии с теорией в двухсайтовом иммунохемилюминометрическом анализе (ЮМА) альфафетопротеина увеличение содержания акридиновой . метки в молекуле антитела с 0,3 до 3,0 позволило повысить чувствительность в 5 раз [7]. Позднее описанный в этой работе прием неоднократно применяли в тех случаях, когда чувствительность анализа являлась главным фактором, ограничивающим сферу применения метода. '

13*3.1. Тиротропин (TSH). Ранее определение концентрации TSH в плазме с помощью обычных методов радиоиммуноана-лиза, как правило, давало удовлетворительные результаты только при обнаружении или контроле повышенной концентрации этого гормона у больных гипотнроидизмом. Лишь наиболее тщательно оптимизированные конкурентные методы иммуноанализа иногда позволяли отличить пониженный уровень TSH при гипертироидиз-ме от нормального [8]. Позднее разработка более совершенных иммунорадиометрических методик для определения TSH и промышленный выпуск соответствующих наборов обеспечили в большинстве случаев возможность определения низких концентраций TSH [9]. Недостатки ш1 как метки выяснились в ходе широкого применения этих наборов, когда обнаружились существенные различия в содержании меченых антител в различных партиях, а оценка малых количеств TSH была неточной из-за очень низких скоростей счета. Возможности неизотопных методов иммуноанализов, основанных на хемилюминеспенции или флуоресценции с временным разрешением, которые в принципе позволяют достоверно дифференцировать больных гипотнроидизмом и здоровых людей, пока еще не полностью реализованы. Важно отметить, что чувствительность этих методов по меньшей мере на порядок выше чувствительности иммунорадиометрического анализа.

13.3.2. Паратироидный гормон (паратирин, РТН). Более интересной задачей была разработка удовлетворительной методики определения паратироидного гормона (РТН). В этом случае достижение необходимой чувствительности осложняется проблемой специфичности. Хотя РТН секретируется как индивидуальный 84-членный пептид, в периферической системе кровообращения в результате метаболизма он большей частью циркулирует в виде С-концевого биологически неактивного фрагмента. По сравнению с биологически активным N-концевым пептидом этот фрагмент относительно медленно выводится из организма. Поэтому методы иммуноанализа, в которых предпочтительно определяется О концевой РТН, имеют ограниченное значение, поскольку они позволяют лишь косвенно оценить паратироидную секреторную активность. Кроме того, интерпретация результатов осложняется при

Рис. 132. Калибровочная кривая для определения интактного паратироидиого гормона человека (РТН) методом ICMA.

почечной недостаточности, которая приводит к снижению скорости вывода этих фрагментов РТН из организма. Напротив, методики специфического определения N-концевого пептида в общем случае недостаточно чувствительны для того, чтобы можно было надежно выявить больных с легкой формой гиперпаратироидизма.

Недавно нами описана методика двухсайтового ICMA, специфичная по отношению к интактным молекулам РТН и достаточно чувствительная для того, чтобы различить пониженный и нормальный уровни РТН [10]. Специфичность достигается за счет использования поликлональных антител (анти 1-34), меченных акридиновым эфиром, и моноклональных антител (анти 44-48), иммобилизованных на твердой фазе. Эти два типа антител охватывают с двух сторон основной центр расщепления молекулы РТН, находящийся, как предполагается, между остатками 33 и 35.

Калибровочный график для определения РТН представлен на рис. 13.2. Зависимость линейна в диапазоне концентраций 0,4-200 пмоль/л, а коэффициент вариации результатов в нескольких анализах не превышает 10% при концентрации РТН от 2 до 200 пмоль/л. Главное достоинство этой методики заключается в стабильности калибровочной прямой. Изучение 15 последовательных определений показало, что коэффициент вариации утла наклона прямой составляет 4%, а отсекаемого отрезка - 7%. Такая стабильность калибровочного графика устраняет необходимость в построении всего калибровочного графика, как это делается обычно, и позволяет проводить калибровку лишь с небольшим числом стандартных образцов, что упрощает лабораторные анализы. Как показано на рис. 13.3, превосходные характеристики этой методики определения РТН позволяют повысить надежность диагнозов. Кроме того, новая методика впервые позволила выявлять небольшие отклонения паратироидной секреторной активности от нормы

1З.Иммунохвмияюмииометрический анализ

183

Рис. 133. Концентрации РТН, найденные с помощью метода ICMA, у здоровых людей и у пациентон с перничным гиперпаратироидизмом, гипопаратироидизмом и с хронической почечной недостаточностью.

у здоровых людей.

13.3.3. Тироксин (Т4). Традиционно низкомолекулярные вещества определяют конкурентными методами с применением меченых гаптенов. Введение неизотопных меток в гаптены связано с множеством проблем, прежде всего с невозможностью разработки универсального способа введения метки. Напротив, введение метки в антитела можно проводить по стандартной методике. Недавно описаны методы ЮМА определения Та с использованием изолюми-нола [11] и акридиновых солей [12]. В этих методах конъюгат гаптена с белком и гаптен из пробы конкурируют за ограниченное количество меченых антител. В разработанной нами системе конъюгат - это Т4, связанный с IgG кролика. Связанную фракцию

ЗДкДЭА Калибровочная кривая определения свободного тироксина методом ICMA.

коиъюгата отделяют путем реакции с вторичными антителами против IgG кролика, иммобилизованными на парамагнитных частицах (Advanced Magnetics, Кембридж, Массачусетс, США). Интенсивность люминесценции, связанной с частицами метки, обратно) пропорциональна концентрации гаптена в пробе. Большая емкость по отношению к антителам использовавшихся в этой работе частиц позволила применять такую концентрацию твердой фазы, которая обеспечивает оптимальное разделение и в то же время уменьшает до минимума гашение люминесценции.

Важно, что мы смогли использовать эту методологию для определения свободного тироксина [13]. Как показано на рис. 13.4, в отсутствие агента, ингибирующего связывание гормона с эндогенными белками, степень связывания меченых антител с кон-ыогатом T4-IgG обратно пропорциональна концентрации свободного гормона. Для предотвращения нарушения равновесия между свободным и связанным Т4 в реакции с антителами оказалась необходимой тщательная оптимизация методики. В первую очередь необходимо было показать, что связывание меченых антител с конъюгатом не зависит от концентрации связывающих белков, что должно было фы- происходить, если бы конъюгированный Т4 реагировал с такими Щелками.

Ценность такого метода.определения свободного Та заключается и возможности использования всех преимуществ РИА при отсутствии недостатков, присущих радиоактивным, изотопам. Пока что ие удалось синтезировать аналоги тироксина, которые реагиро-

вали бы с антителами и не взаимодействовали бы со связывающими белками. Поэтому широко применяемый в настоящее время метод РИА с радиоактивным аналогом тироксина, по-видимому, не позволяет с достаточной достоверностью определять концентрацию свободного гормона [14]. Напротив, клинические данные, полученные при обследовании пациентов с нетироидными заболеваниями и аномальным содержанием связывающих белков, подтверждают предположение о том, что хемилюминесцентный метод ICMA способен обеспечить такую достоверность в определении свободного тироксина (Т4).

Узнай, как осуществить взлом в контакте бесплатно у нас на сайте.

Методы иммуноанализа

Scroll To Top
[ Reset Settings ]
Rambler's Top100
Картаsns krf e0 nd5 ah81 rod solnce rod solnc cent1 cen40
rss
Карта