Новые методы иммуноанализа - НОСИТЕЛИ И РЕАКТИВЫ

 

Для того чтобы молекулы реагентов связались с носителем или ковалентно, или за счет физических сил (т.е. путем пассивной адсорбции), они должны достигнуть поверхности носителя. Перечислим наиболее важные взаимосвязанные факторы, определяющие эффективность пассивной адсорбции: 1) диффузионные характеристики (расстояние и скорость); 2) время инкубации; 3) температура реакционной смеси; 4) концентрация реагента; 5) вязкость раствора. Роль каждого фактора детально обсуждена в обзоре [7].

4.3.1. Диффузионные характеристики. Влияние этого фактора можно проиллюстрировать на примере адсорбции реагента на поверхности двух сосудов, выполненных из одинакового материала, но отличающихся по форме (рис. 4.2). В меньшем сосуде время инкубации, необходимое для достижения максимальной адсорбции реагента на его стенках, будет меньше, чем в сосуде большего размера. Это объясняется скоростью диффузии, которая обратно пропорциональна размеру молекулы (точнее, ее гидродинамическому  объему) и вязкости растворителя. Кроме того, скорость адсорбции прямо пропорциональна отношению площади поверхности к объему раствора, поэтому при выборе формы носителей для иммуноанализа необходимо стремиться к тому, чтобы это отношение было как можно большим.

Рис 4.2. Влияние длины пути диффузии на вероятность столкновения реагента с поверхностью, х и - расстояния, преодолеваемые молекулой реагента за время t и 2t соответственно.

Рис. 4.3. Зависимость связывания антител на поверхности лунок микропланшета от времени.


4.3.2. Время инкубации. Время является одной из важнейших переменных, определяющих эффективность процесса связывания. Как видно из данных, представленных на рис. 4.3, зависимость степени адсорбции антител на стенках лунок микропланшета от времени нелинейна. Для получения количественных характеристик процесса адсорбции через определенные промежутки времени в систему добавляли избыток антигена, меченного ферментом, далее микропланшет промывали, добавляли в лунки раствор субстрата и по завершении ферментативной реакции измеряли оптическую плотность раствора. Чем больше время инкубации, тем больше молекул реагента связывается с носителем; этот процесс продолжается до тех пор, пока не наступит насыщение твердой фазы или истощение раствора.

4.3.3. Температура реакционной смеси. Молекулярное движение не упорядочено, и число молекул реагента, достигающих поверхности, является функцией скорости их направленного движения и расстояния. При повышении температуры реакционной смеси скорость движения молекул возрастает. Большинство биомолекул стабильно при 37 °С. Поэтому эта температура чаще всего используется для сокращения времени инкубации. Более высокие температуры могут вызвать денатурацию белков и связанные с этим погрешности результатов иммуноанализа. Другим недостатком инкубации при температуре выше 37 °С является необходимость предварительного прогрева носителей до заданной температуры перед началом процесса сорбции. Если эту операцию исключить, то возникающий температурный градиент может оказывать сильное влияние на состояние границы раздела фаз, а тем самым и на скорость превращения субстрата. Подобные эффекты особенно заметны, если в качестве метки используется щелочная фосфатаза.

4.3.4. Концентрация реагентов. Адсорбция различных белков не зависит от их качественного состава, если только общая нагрузка не превышает сорбционной емкости твердой фазы [8 ], которая для большинства полистирольных микропланшетов и пробирок составляет около 4 мкг белка в 1 мл буферного раствора [7 ]. Количество связавшегося конкретного белка зависит от его сродства к поверхности материала. Кроме того, на обнаружение связанного определяемого вещества оказывают влияние пространственные факторы, причем возможны ситуации, когда присутствующие в анализируемом образце в небольших концентрациях примеси дают более сильный сигнал. Если используют растворы с очень низкими концентрациями реагентов, то для уменьшения фонового сигнала оставшиеся свободными центры на поверхности носителя необходимо блокировать каким-либо инертным веществом, не влияющим на реакцию антиген - антитело. Чаще всего для этих целей используют бычий сывороточный альбумин (БСА), желатин, сыворотки или детергенты.

4.3.5. Вязкость реакционной смеси. Если раствор имеет высокую вязкость, то молекулы реагентов будут двигаться медленнее. Буферный раствор, к которому добавлено 10% сыворотки, более вязок, чем такой же буферный раствор, не содержащий белков.

Из приведенных данных следует, что эффективное взаимодействие иммунореагентов с носителем обеспечивается, если выполнены следующие условия:

1) длина диффузионного пути минимальна;

2) концентрация сорбируемого реагента вплоть до насыщения поверхности носителя максимальна;

3) вязкость буферного раствора минимальна;

4) реакции осуществляются при максимально высоких температурах, не вызывающих денатурации белка; буферные растворы предварительно прогревают до той же температуры;

5) время инкубации определено заранее; перемешивание реакционной смеси сокращает продолжительность этой стадии.

Методы иммуноанализа

Scroll To Top
[ Reset Settings ]
Rambler's Top100
Картаsns krf e0 nd5 ah81 rod solnce rod solnc cent1 cen40
rss
Карта