Информационный сайт для врачей и студентов-медиков

Новые методы иммуноанализа - НОСИТЕЛИ И РЕАКТИВЫ

Для того чтобы данный носитель можно было использовать в иммуноанализе, он должен удовлетворять следующим требование ям: 1) обладать высокой связывающей способностью по отношению к иммобилизуемому реагенту; 2) незначительно десорбировать реагент; 3) иметь низкий уровень неспецифического связывания; 4) обладать воспроизводимыми свойствами и характеристиками.

 В зависимости от способа обработки поверхности применяемые в настоящее время для пассивной адсорбции полистирольные носители можно подразделить на три типа (табл. 4.1).

Таблица 4.1. Характеристики поверхностей полистирола, обработанного тремя различными способами

Тип

Зарядовый

Характеристики

Связывание

 

индекс

поверхности

IgG

X

1

Неполярная гидрофобная

Среднее

Y

12

Полярная гидрофобная

Эффективное

Z

200

Полярная гидрофильная

Неэффективное

Определено методом Раппопорта и др. [14].

Использовали стандартную методику адсорбции в карбонатном буфере, рН 9,6. Оценены по способности поверхности удерживать воду.

Тип X имеет гидрофобную неполярную поверхность, хорошо связывающую большинство белков и гликопротеинов. Полистирол типа Y представляет собой носитель с полярной гидрофобной поверхностью, получаемой окислением, например, под действием гамма-лучей. Оказалось, что такие поверхности лучше всего подходят для связывания гликопротеинов. Поверхность полистирола типа Z специально разработана для культивирования клеток ткани. Обычно поверхность полистирола этого типа заряжена отрицательно, хотя можно приготовить носитель и с положительными зарядами. Носители этого типа очень плохо связывают IgG, а связавшиеся молекулы легко десорбируются в растворах с более высокой ионной силой.

                                                          RaM, нг/мл

+ Тип А     х Тип В     * Тип С

Рис. 43. Связывание антимышиного IgG кролика (RaM) с полистиролом трех типон.

Полистирольные микропланшеты.
В ряде экспериментов показаны различия в эффективности связывания белков разными типами полистирольных
  микропланшетов в идентичных (не всегда оптимальных) условиях. Для этой цели использовали двухстадийный метод определения связывания IgG. На первом этапе IgG кролика (Dakopats) растворяли в солевом фосфатном буфере (СФБ) при рН 8,2 (или другом заданном рН). 

                                                    RaM/мл

+ Тил А   х Тип В   * Тип С

Рис. 4.6. Влияние способа обработки поверхности на связывание антимышиного IgG кролика (RaM) с полистиролом трех типов.

Аликвоты по 200 мкл добавляли в лунки и инкубировали в течение ночи при 20 °С. Лунки промывали три раза раствором СФБ с тритоном X-100 (рН 7,2) (СФБТ) и свободные центры связывания блокировали 0,5%-ным раствором БСА в СФБ. Далее в каждую лунку добавляли антитела свиньи против IgG кролика, конъюгированные с пероксядазой хрена (Dakopats, 2,4 мкг/мл в СФБ, рН 7,2), и инкубировали 4 ч при 20 °С. Избыток конъюгата удаляли трехкратной промывкой раствором СФБТ. Для обнаружения связавшихся антител использовали цветную реакцию с пероксидом водорода и орто-фенилдиамииом. Оптическую плотность в лунках измеряли с помощью фотометра NJ-2000 ImmunoReader (Jasco).

Результаты определения связывающей способности трех типов полистирола представлены на рис. 4.5. Нетрудно видеть, что наибольшим сродством к IgG кролика обладает полистирол типа А.

На рис. 4.6 представлены результаты изучения связывающей способности трех типов полистирола после их обработки гамма-лучами. Во всех трех случаях наблюдается существенное увеличение сродства белков к носителю.

Влияние рН на связывание белков с полистиролами X, Y и Z продемонстрировано на рис. 4.7, 4.8 и 4.9 соответственно. Сорбирующая способность полистирола X, имеющего гидрофобную поверхность, сильно зависит от рН и ионной силы раствора (рис 4.7). Оптимальные результаты были получены при использовании буферного раствора с низкой ионной силой и рН, соответствующим изозлектрической точке белка. Связывающая способность полистирола Y гораздо менее чувствительна к изменению рН и ионной силы буферного раствора (рис. 4.8). Оптимальная сорбция

Рис. 4.7. Влияние рН иа связывание антимышиных IgG кролика (RaM) с неполярным гидрофобным полистиролом (тип X).

Рис. 4.8. Влияние рН на связывание антимышииого IgG кролика (RaM) с полярным гидрофобным полистиролом (тип Y, обработанный гамма-лучам н).

наблюдалась в буферном растворе, рН которого немного выше изо-электрической точки связываемой молекулы белка. В случае полистирола типа Z молекулы иммуноглобулинов могут связываться с его отрицательно заряженной поверхностью в буферных растворах с рН ниже их изоэлектрической точки (рис. 4.9). Однако они легко смываются, если использовать растворы с более высокой ионной силой. Поэтому этот тип полистирола редко используется в имму-ноанализе.

4.5.2. Ковалентное связывание. Поверхность носителя можно модифицировать и для ковалентного связывания. Описано несколько методов связывания реагентов с амино- или карбоксильными группами носителя с помощью глутарового альдегида, водорастворимых карбодиимидов, суберимидатов и других бифункциональных реагентов [1-19]. Однако эти методы дают несогласующиеся результаты. Кроме того, для широкого использования в иммуноанализе необходимы дальнейшие поиски путей повышения их чувствительности и специфичности.

4.6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Для связывания иммунореагентов можно использовать большое число неорганических и органических носителей, имеющих самую различную форму. Наиболее детально исследован процесс пассивной адсорбции иммуноглобулинов на поверхности полисти-рольных микропланшетов и трубок. Хотя природа механизма связывания до конца ие выяснена, известно, что ряд факторов, таких; как рН, ионная сила, температура, продолжительность процесса,

Рис. 4.9. Влияние рН на связывание антимышиного IgG кролика (RaM) с отрицательно заряженным полярным гидрофильным полистиролом (тип Z, для культур тканевых клеток).

вязкость и свойства самого носителя, оказывают существенное влияние на точность и воспроизводимость иммунометрического анализа. Для получения оптимальных результатов необходимо очень тщательно подбирать все вышеперечисленные параметры.

В настоящее время иммуноглобулины можно эффективно связывать на имеющихся в продаже полистирольных носителях нескольких типов. Дальнейшие усилия должны быть направлены на получение высокоспецифичных носителей, селективно связывающих другие типы молекул.

Методы иммуноанализа

Scroll To Top
[ Reset Settings ]
Rambler's Top100
Картаsns krf e0 nd5 ah81 rod solnce rod solnc cent1 cen40
rss
Карта